Resistenza alla chemioterapia e il ruolo di p53: una prospettiva a singola molecola

Il gene TP53 è mutato o inattivato in circa il 50% di tutti i tumori umani, il che ne fa il soppressore tumorale più frequentemente alterato tra i diversi tipi di cancro (Olivier et al., 2010). Tuttavia, le sole mutazioni del gene non spiegano pienamente perché alcuni tumori resistono alla chemioterapia e alla radioterapia mentre altri rispondono. Comprendere il ruolo di p53 nella resistenza alla chemioterapia richiede di andare oltre il codice genetico. Un numero crescente di evidenze punta al comportamento dinamico della proteina p53 stessa: come la sua concentrazione cambia nel tempo, quanto a lungo rimane legata al DNA, e come questi pattern determinino se una cellula tumorale sopravvive o muore.

Un nuovo progetto di ricerca dell’Università Vita-Salute San Raffaele, finanziato dal grant del Fondo Italiano per la Scienza (FIS) del Ministero dell’Università e della Ricerca, sta ora indagando questa domanda a livello di singola molecola. Guidato da Davide Mazza, Professore Associato all’Università Vita-Salute San Raffaele e Vice Direttore del Centro di Imaging Sperimentale dell’ IRCCS Ospedale San Raffaele di Milano, il progetto mira a decodificare come le dinamiche di p53 influenzino l’espressione genica e, in ultima analisi, il destino delle cellule tumorali in risposta alla terapia.

«Questa domanda è particolarmente rilevante se vogliamo comprendere e risolvere la resistenza del cancro alle terapie convenzionali, come la chemioterapia o la radioterapia. È noto che le mutazioni genetiche possano spiegare in parte tale resistenza ai farmaci delle cellule tumorali, ma esistono ulteriori fattori non genetici che possono essere coinvolti. Le dinamiche di p53 potrebbero essere uno di questi fattori», spiega il Professor Mazza.

Perché le dinamiche di p53 sono rilevanti per la resistenza alla chemioterapia

La proteina p53, spesso definita il guardiano del genoma, è un fattore di trascrizione che controlla l’espressione di geni che promuovono la sopravvivenza o la morte cellulare in risposta al danno al DNA. Per decenni, la ricerca si è concentrata principalmente su come le mutazioni di TP53 disabilitino questa funzione protettiva: le mutazioni somatiche di TP53 si verificano con frequenze che vanno dal 38–50% nei tumori ovarici, colorettali e polmonari, fino a circa il 5% nella leucemia primaria e nel melanoma (Olivier et al., 2010; Chen et al., 2022). Eppure, anche nei tumori in cui p53 conserva la sua forma wild-type, le cellule tumorali possono resistere alla terapia, a suggerire che il comportamento dinamico della proteina (François et al., 2026)— non solo la sua sequenza genetica — giochi un ruolo decisivo nella resistenza alla chemioterapia.

Il laboratorio del Professor Mazza presso il Centro di Imaging Sperimentale ha pionieristicamente sviluppato l’uso di microscopi costruiti su misura, capaci di tracciare singole molecole di p53 marcate con fluorescenza mentre si muovono all’interno di cellule viventi con risoluzione nanometrica. Questo approccio a singola molecola consente ai ricercatori di osservare non solo quanta p53 sia presente, ma come interagisca con il DNA e i geni target in tempo reale.

Lavori precedenti del gruppo hanno caratterizzato, in termini biofisici quantitativi, come p53 navighi nell’architettura nucleare cellulare e come diversi domini proteici, spesso mutati nel cancro, contribuiscano al riconoscimento del target e alla funzione oncosoppressiva (Loffreda et al., 2017; Mazzocca et al., 2023).

Il ruolo di p53 nel destino delle cellule tumorali

Il progetto finanziato dal FIS si basa su esperimenti preliminari che hanno rivelato un pattern sorprendente nel modo in cui p53 controlla l’espressione genica a seguito del danno al DNA indotto dalla chemioterapia. In una linea cellulare di tumore al seno trattata con chemioterapia, il Professor Mazza e il suo team hanno osservato che i livelli di p53 aumentano gradualmente dopo il danno al DNA, ma i geni target rimangono completamente silenziosi per ore. Poi, in modo apparentemente improvviso, la loro trascrizione si attiva e rimane tale. Questa transizione varia da cellula a cellula e non è perfettamente correlata con la concentrazione istantanea di p53.

«L’idea alla base di questo esperimento preliminare era di indagare come le dinamiche di p53 si correlassero con l’espressione dei geni a valle che regolano la sopravvivenza delle cellule tumorali. I risultati sono stati inaspettati: p53 sembrava comportarsi come un interruttore digitale — vale a dire, i livelli proteici aumentavano per ore prima che si potesse rilevare qualsiasi cambiamento nell’espressione del trascritto CDKN1A. Tuttavia, una volta che CDKN1A era attivo, rimaneva attivo, indipendentemente dai livelli di p53, correlato a una risposta positiva delle cellule tumorali alla chemioterapia», spiega il Prof. Mazza.

Un interruttore digitale, in questo contesto, significa che p53 non aumenta gradualmente l’attività dei suoi geni target in proporzione alla propria concentrazione. Agisce invece più come un meccanismo binario: l’espressione genica rimane spenta fino a quando non viene soddisfatta una condizione critica, poi si attiva in modo decisivo. Questo comportamento è stato osservato specificamente con CDKN1A — un gene che codifica la proteina p21, che blocca la divisione cellulare inibendo le chinasi ciclina-dipendenti. Quando CDKN1A viene attivato, la cellula entra in arresto del ciclo cellulare: smette di dividersi, dando al macchinario di riparazione del DNA il tempo di riparare i danni causati dalla chemioterapia. Questo meccanismo è un passaggio chiave per impedire alle cellule tumorali danneggiate di continuare a proliferare.

In condizioni sperimentali diverse, l’attivazione di p53 ha prodotto solo un aumento transitorio della trascrizione dei geni target: un comportamento ON/poi OFF che ha in ultima analisi permesso alle cellule tumorali di riparare il danno al DNA indotto dalla terapia, promuovendo la sopravvivenza cellulare piuttosto che la morte. Questa differenza tra attivazione genica sostenuta e transitoria potrebbe essere uno dei meccanismi non genetici alla base della resistenza alla chemioterapia mediata da p53.

 Immagine di cellule fissate, ottenuta mediante tecnica di smFISH (single molecule Fluorescent In Situ Hybridization), che permette di contare quante molecole di un determinato RNA/Gene sono espresse in quel momento in ciascuna cellula (ogni puntino = 1 RNA). 

Due modelli per spiegare l’attivazione genica di p53

Due modelli concettuali potrebbero spiegare come p53 determini se un gene target si attiva in modo permanente o solo transitoriamente, una distinzione che potrebbe essere centrale per comprendere i meccanismi di resistenza ai farmaci oncologici. Discriminare tra questi due scenari è essenziale per chiarire il ruolo di p53 nella resistenza alla chemioterapia a livello meccanicistico.

Nel modello a soglia, un gene si attiva una volta che p53 supera un livello di concentrazione fisso. Si tratta dell’ipotesi più semplice: la cellula fissa un livello, e una volta che le concentrazioni proteiche di p53 lo superano, la trascrizione ha inizio.

Nel modello a memoria, il gene integra l’esposizione a p53 nel tempo, “registrando” l'entità di questa esposizione. In altre parole, il gene target ha una forma di memoria molecolare: tiene traccia di quanta p53 ha “visto” nelle fasi iniziali, e questa storia cumulativa (piuttosto che la concentrazione istantanea) determina se la trascrizione viene innescata.

«Vorremmo testare entrambi i modelli, dissezionare i meccanismi molecolari che li sottendono e, infine, correlare le dinamiche di p53 e la trascrizione dei geni target con il destino cellulare pro-sopravvivenza o pro-morte, prima in linee cellulari tumorali e poi in organoidi 3D di cancro colorettale metastatico derivati da pazienti. Questi ultimi saranno sviluppati grazie alla nostra collaborazione con il gruppo guidato dal Professor Giovanni Tonon, direttore del Centro per le Scienze Omiche e responsabile del laboratorio di Genomica Funzionale del Cancro al San Raffaele», spiega il Prof. Mazza.

Dai microscopi al machine learning: prevedere la resistenza alla chemioterapia

L’imaging di strutture tridimensionali come gli organoidi tumorali derivati da pazienti, repliche miniaturizzate, cresciute in laboratorio, del tumore di un paziente, che preservano l’architettura tissutale originale e le caratteristiche genetiche, richiede nuova strumentazione che verrà sviluppata nell’ambito del progetto finanziato dal FIS. «Stiamo lavorando per costruire un microscopio avanzato a piano obliquo capace di imaging volumetrico rapido e con bassa fototossicità. L’obiettivo finale è utilizzarlo per acquisire immagini delle dinamiche live di p53 in organoidi tumorali derivati da pazienti».

I dati di imaging live verranno poi integrati con FISH a singola molecola ad alto multiplexing (ibridazione fluorescente in situ): una tecnica che utilizza sonde fluorescenti per evidenziare la presenza di specifiche molecole di RNA, consentendo ai ricercatori di visualizzare simultaneamente l’espressione di decine di geni target in campioni di tessuto fissato, come le biopsie tumorali.

Questa integrazione di microscopia su cellule vive con istantanee dell’espressione genica servirà anche ad addestrare un modello di machine learning. Una volta addestrato, il sistema di intelligenza artificiale dovrebbe essere in grado di prevedere come la trascrizione di diversi geni target, rilevata con FISH, rifletta le dinamiche sottostanti di p53 e come questo si traduca nel destino cellulare pro-sopravvivenza o pro-morte in risposta alla chemioterapia o alla radioterapia. In pratica, ciò significa che i pattern di regolazione dell’espressione genica di p53 osservati in laboratorio potrebbero diventare biomarcatori predittivi della resistenza alla chemioterapia in ambito clinico.

«Se questo approccio avrà successo, potrebbe aiutare a prevedere come un tumore risponderà alla chemioterapia o alla radioterapia utilizzando solo materiale bioptico fissato. Questa strategia, che deriva dall’applicazione potente della microscopia avanzata alla ricerca di base in biologia, potrà informare future scelte terapeutiche in ambito clinico», conclude il Professor Mazza.

La capacità di prevedere la risposta alla terapia a partire da una biopsia standard, senza necessità di imaging su cellule vive in ambito clinico, potrebbe rappresentare un passo avanti significativo. Rivelando come le dinamiche di p53 modellino la resistenza alla chemioterapia a livello molecolare, questa ricerca apre la porta a strategie di trattamento oncologico più precise e personalizzate.