CRISPR/Cas9, le rivoluzionarie “forbici genetiche” da Nobel

Il Premio Nobel per la Chimica 2020 è stato assegnato a Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier per il loro contributo fondamentale alla scoperta di un metodo efficace di editing genetico, vale a dire un intervento di precisione che consente di introdurre modificazioni desiderate all’interno del DNA in modo semplice, efficace, veloce ed economico. La tecnologia sviluppata, chiamata CRISPR/Cas9, rappresenta una vera e propria rivoluzione per la ricerca biomedica, poiché consente anche di correggere mutazioni patologiche in modo specifico.

Spesso in ambito scientifico i ricercatori traggono ispirazione dalla natura: CRISPR/Cas9 non fa eccezione, essendo presa in prestito dai batteri.

Batteri e strategie di difesa

In natura sono sempre esistiti prede e predatori. Nel mondo microscopico dei batteri, i predatori, o meglio gli invasori, sono rappresentati dai batteriofagi: sono virus che attaccano i batteri, nei quali iniettano il proprio materiale genetico per iniziare la replicazione.

Per difendersi da questo attacco indesiderato, i batteri hanno sviluppato un sistema ingegnoso: delle “forbici” molecolari estremamente precise che tagliano il DNA dell’invasore e lo inattivano, impedendo così l’infezione.

Illustrazione che mostra l’infezione di un batterio da parte di alcuni batteriofagi. I batteriofagi (in verde) si “aggrappano” alla membrana del batterio (in arancione) e iniettano al suo interno il proprio acido nucleico. Per difendersi, il batterio ha sviluppato il sistema CRISPR/Cas9, che taglia l’acido nucleico del batteriofago in punti specifici.

Ancora più sorprendente è il fatto che, mediante il sistema CRISPR/Cas9, i batteri siano in grado di memorizzare geneticamente le infezioni già avvenute, permettendo quindi al batterio di rispondere prontamente ad un eventuale secondo incontro con il patogeno e di tramandare questa risposta alla loro progenie.

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Qualche dettaglio su CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 (talvolta per brevità chiamato solo CRISPR, pronunciato “crisper”) è un complesso composto da due parti, che insieme hanno la funzione di individuare il punto desiderato sul DNA bersaglio e tagliarlo.

Schema illustrativo del meccanismo di azione di CRISPR/Cas9. 1) In un primo momento si assembla il complesso CRISPR/Cas9, composto dall’RNA guida specifico per la sequenza da tagliare e dalla nucleasi Cas9. 2) L’RNA guida funziona da ancora, fermando Cas9 esattamente sul punto del DNA bersaglio dove si vuole effettuare il taglio. Cas9 introduce nel DNA una rottura della doppia elica. 3) Il DNA può andare incontro a una riparazione da parte dei naturali meccanismi della cellula, oppure essere corretto con nuove informazioni geniche.

In particolare:

• CRISPR è implicata nel riconoscimento delle sequenze da tagliare. Questo riconoscimento è assolutamente specifico e avviene grazie a un’apposita molecola di RNA, detta “RNA guida” (la cui sequenza è complementare a quella del sito che si vuole tagliare sul DNA), che può essere facilmente modificata in laboratorio. Come dice il nome stesso, l’RNA guida “orienta” Cas9, l’altra componente del complesso, indicandole dove effettuare il taglio.
• Cas (seguita da un numero, di solito 9) è una nucleasi, ossia un enzima che taglia il DNA, ed è infatti responsabile del taglio della molecola bersaglio. Una volta associata a Cas9, l’RNA guida agisce come una specie di “ancora”, fermando Cas9 sulla sequenza di DNA scelta. Cas9, il cui nome sta per CRISPR-associated*, introduce una rottura della doppia elica nel sito prescelto, e può essere programmata per effettuare specifiche modifiche al genoma di una cellula.
  

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Una volta tagliato, il DNA può essere aggiustato dai naturali meccanismi di riparazione della cellula; in alternativa, attraverso opportuni accorgimenti, è possibile eliminare sequenze di DNA dannose dal genoma bersaglio oppure sostituire delle sequenze, andando ad esempio a correggere delle mutazioni causa di malattie.

Ma esattamente, come mai CRISPR/Cas9 è una tecnica rivoluzionaria? Perché ha meritato il Premio Nobel? Quali sono le sue potenzialità? Lo abbiamo chiesto al Dott. Angelo Lombardo, Group leader dell’Unità “Regolazione epigenetica ed editing genetico mirato” dell’IRCSS Ospedale San Raffaele e ricercatore UniSR.

Dott. Lombardo, cos’è CRISPR/Cas9?

CRISPR/Cas9 è un sistema di editing genetico mirato molto versatile. Il complesso CRISPR/Cas9 induce una rottura della doppia elica DNA, attivando così processi di riparo altamente conservati che possono portare all’inattivazione del gene stesso.

Questi processi possono anche essere sfruttati per inserire nuove informazioni geniche all’interno del sito bersaglio di CRISPR/Cas9, o per correggere mutazioni patologiche. Una volta modificato, CRISPR/Cas9 può anche essere utilizzato per indirizzare sul DNA fattori che attivano o inibiscono l’espressione dei geni.

A sinistra, la struttura della nucleasi Cas9 (in rosa) catturata nello stato attivo: in rosso, l’RNA guida necessario per l’attività dell’enzima. A questo filamento si appaia un tratto di DNA (in verde) che viene svolto e tagliato, lasciando un frammento appaiato (in celeste) a valle del punto di scissione. Nella figura a destra una parte della proteina Cas9 (il dominio HNH, responsabile per parte dell’attività di Cas9) è stata esclusa per consentire di apprezzare come il DNA bersaglio e l’RNA guida formino una doppia elica ibrida e favorisca l’apertura del DNA, consentendone il taglio in una posizione specifica. Gentile concessione del Dott. Massimo Degano, Group leader Unità di Biocristallografia, IRCCS Ospedale San Raffaele.

Perché la scoperta di CRISPR/Cas9 merita il Premio Nobel?

L’avvento di CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato la ricerca biomedica, rendendo l’editing genetico una procedura semplice e veloce. Dal punto di vista clinico, la precisione di questa nuova forma di medicina molecolare apre interessanti prospettive alla terapia di molte malattie.

Infine, con il Nobel, è stato premiato un lungo e virtuoso percorso di ricerca, che è culminato nella caratterizzazione molecolare del meccanismo d’azione di CRISPR/Cas9 e alle prime dimostrazioni di come questo sistema possa essere utilizzato per l’editing genetico mirato.

Quali sono i campi di applicazione di CRISPR/Cas9 nell’ambito dell’editing genetico?

Il sistema CRISPR/Cas9 è estremamente versatile e facile da utilizzare, e questo lo rende ideale per molte applicazioni. Queste spaziano dalla ricerca biomedica alla terapia e alla diagnostica, dalla generazione di modelli animali di malattia alla modificazione genica mirata in agronomia e zoologia.

Cosa c’era prima di CRISPR/Cas9?

Prima di CRISPR/Cas9 (o A.C., Avanti CRISPR) esistevano altri sistemi di editing genetico mirato. Tra i più efficienti vale la pena ricordare le nucleasi a dita di zinco (o ZFN) e le TALEN, due sistemi di editing genetico tuttora in uso e già in clinica.

A differenza di CRISPR/Cas9, le ZFN e le TALEN sono più complesse da programmare, e quindi meno diffuse. Tuttavia, il loro uso è largamente sovrapponibile a quello di CRISPR/Cas9. La decennale esperienza di ricerca e in ambito clinico acquisita con le ZFN e le TALEN ha permesso un rapido sviluppo di CRISPR/Cas9.

Cosa si fa attualmente e cosa si farà al San Raffaele con questa tecnica innovativa?

L’Istituto San Raffaele è stato tra i pionieri dell’editing genetico mirato. Ad oggi, CRISPR/Cas9 è diventato pratica comune nella ricerca biomedica dell’Istituto, e numerosi laboratori ne stanno valutando il potenziale in ambito terapeutico.

In particolare, studi preclinici mostrano risultati incoraggianti nel trattamento di numerose malattie genetiche rare e nell’immunoterapia del cancro. Dato il potenziale di CRISPR/Cas9, è plausibile che questa promettente tecnologia avrà molte altre applicazioni terapeutiche.

*CRISPR è invece un acronimo che sta per “Clustered regularly interspaced short palindromic repeats”, come a dire “grappolo di corte sequenze ripetute aventi certe caratteristiche e distribuite uniformemente nel DNA”.